熒光分光光度計(jì)定量分析時多采用工作曲線法，即以已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按試樣相同方法處理后，配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其相對熒光強(qiáng)度和空白溶液的相對熒光強(qiáng)度，扣除空白值后，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。
然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強(qiáng)度，扣除空白值后，從工作曲線上求出熒光物質(zhì)的含量。
在熒光分光光度計(jì)用熒光分析法測定某些會引起熒光改變的微量物質(zhì)時，常采用差示熒光法，可使熒光強(qiáng)度的讀數(shù)差距拉大，使熒光強(qiáng)度的降低加大，從而提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。
在使用時需要注意開機(jī)次序，光度計(jì)開機(jī)順序一般為先開氙燈，然后開儀器主機(jī)，接著開跟儀器連接的計(jì)算機(jī)。如此操作的原因在于穩(wěn)態(tài)氙燈是高壓點(diǎn)亮，為了避免瞬問脈沖電流對周圍設(shè)備造成影響，需要先開氙燈，等電流穩(wěn)定后再打開周邊的電腦等設(shè)備。關(guān)機(jī)順序則相反。
熒光分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)：
1、樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。
2、在使用儀器進(jìn)行熒光分析時，為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機(jī)預(yù)熱氙燈大約30分鐘。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時間可以縮短到10分鐘左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長波長、低人射光強(qiáng)度及短時間光照。
3、溫度變化可引起儀器熒光強(qiáng)度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強(qiáng)度增大。溫度影響熒光強(qiáng)度的明顯程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結(jié)果幾乎無影響。
4、當(dāng)儀器的熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強(qiáng)度有較大影響。因?yàn)槿跛峄蛉鯄A在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。
5、熒光分光光度計(jì)的熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、02、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。
溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此在較嚴(yán)格的熒光實(shí)驗(yàn)中必須除氧。
